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寻找细菌耐药性来源

靶向深度测序鉴定导致结核病悄然爆发的多药耐药性结核分枝杆菌菌株。

寻找细菌耐药性来源

寻找细菌耐药性来源

简介

人们通常认为结核病(TB)已成为过去,但这一潜在的致死性疾病仍然是全球十大死亡原因之一,该疾病曾被称为“肺痨”。根据世界卫生组织(WHO)的数据,2017年有1000万人被诊断出患有TB,并且有160万人死于该疾病。1当前罹患该疾病的人数如此之多的一部分原因是细菌的进化能力,即使面对4种特异性抗菌药物的6个月治疗方案时依然如此。这种疗法已经使用了几十年,随着时间的推移,许多TB菌株甚至对曾经有效的一线药物(例如异烟肼和利福平)也产生了耐药性。2017年,超过50万的新TB病例对利福平耐药,或对异烟肼和利福平均耐药,这意味着多药耐药性(MDR)已经出现,它会让这一疾病更加难治,更容易传播。2TB爆发的早期检测和新MDR-TB菌株的有效鉴定已成为抗击该病的关键。

Philip Supply博士是里尔巴斯德研究所(Institut Pasteur de Lille)感染与免疫中心法国国家科学研究中心(CNRS)的高级研究员和研究主任,他职业生涯的大部分时间都在研究导致TB的细菌(结核分枝杆菌)的内部机制。GenoScreen是一家能提供先进的测序和基因组学分析服务的法国生物技术公司,作为该公司的科学顾问,Supply博士帮助他们开发了新的靶向深度测序检测Deeplex Myc-TB。该检测灵敏、准确,可直接使用临床痰液样本来鉴定耐药TB菌株,不需要进行耗时的细菌培养。

iCommunity采访了Supply博士,了解了日益严重的MDR-TB问题,Illumina新一代测序(NGS)系统为他们的检测带来的价值,还了解了Deeplex Myc-TB检测的开发以及它如何用于MDR-TB菌株的检测,并限制TB在不知不觉中爆发。

Philip Supply博士是里尔巴斯德研究所感染与免疫中心CNRS的高级研究员和研究主任,也是GenoScreen的科学顾问。

Q:您对TB的细菌基因组学和分子流行病学的兴趣因何而起?

Philip Supply (PS): 在我职业生涯的早期,我研究的是与酵母遗传学相关的非常基础的问题。但我更想开展能直接为公众造福的研究。我联系了法国北部里尔巴斯德研究所的负责人,他建议我研究TB。里尔巴斯德研究所是一个世纪前研制出最初的抗TB疫苗——卡介苗(Bacillus of Calmette-Guerin, BCG)——的地方,这里有深厚的TB研究历史。在那次谈话中,我了解了很多与TB现在的严重程度相关的内容。

Q:为什么TB如此难以根除?

PS: TB是一种能悄悄传播的传染性疾病。在确诊之前,患者可能有相当长的一段时间没有明显的TB感染临床症状。这使得正确诊断该疾病并追踪它的传播变得极为重要。但由于该细菌高度克隆化的群体结构等特点,想要在人群中追踪TB的传播非常困难。TB菌株之间的多样性较低,因此需要非常精确的分子工具才能追踪菌株及其在人群中的传播。获得的数据可用于鉴定TB患者以及他们接触过的所有人,并确定流行菌株的传播,描述爆发情况。

Q:目前TB如何进行治疗?

PS: 与其他细菌性感染相比,TB非常难治,它需要非常严格的治疗方案。最简单的疗程需要6个月,并且仅在患者的TB菌株对当前的一线抗生素敏感的情况下才有效。在此方案中,TB患者每天需要服用4种药,持续2个月。在接下来的4个月中,他们还需要继续服用其中的2种药,以确保治愈。

不幸的是,这些一线药物已经使用了很长时间,并且已经产生了耐药菌株。被耐药菌株感染的患者需要使用时间更长、更复杂的治疗方案。这些患者的治疗方案可能会长达两年,并需要使用5–7种效率较低且副作用更大的药物。这会影响治疗的成功率和死亡率。

据WHO估计,每年约有50万名新患者患有对利福平耐药的TB或MDR-TB。但他们之中只有25%被诊断为此类者患并得到了相应的治疗。这种诊断缺口反映了一个巨大的问题。2

“Deeplex Myc-TB检测可直接使用从细菌量较少的临床样本中提取的DNA,减少了培养的需求,加快了分析速度。”

Q:医生如何才能知道他们面对的是不是该疾病的耐药菌株?

PS: 鉴定耐药TB菌株的经典方法是收集感染患者的痰液样本,在培养基中培养细菌,并检测获得的分离株的抗生素敏感性。如果菌株对异烟肼和利福平等一线TB药物耐药,则需要进行额外的培养来检测其在二线药物存在时的生长情况。此方法的困难之处在于这些细菌的生长十分缓慢。可能需要2个月才能进行完整的诊断。

Q:有针对MDR-TB的新药吗?

PS: 在过去几年中,人们在治疗MDR-TB方面取得了重大进展,一些新药已经上市。贝达喹啉(bedaquiline)在2012年获得批准。不幸的是,我们已经看到了其耐药性的出现。德拉马尼(delamanid)于2014年获得批准,培托马尼(pretomanid)正在美国接受监管审查。

Q:Deeplex Myc-TB检测如何鉴定耐药TB菌株?

PS: :Deeplex Myc-TB是基于NGS的靶向检测,与全基因组测序(WGS)检测不同。虽然WGS检测可以全面了解TB菌株中的所有突变,但运行该检测所需的大量DNA仍然是一个问题。7–10天的TB培养才能获得足够的DNA来进行WGS检测。这是一个很大的局限性,可能会延迟耐药TB菌株的鉴定。

因此,我们转向了靶向测序方法,该方法会先扩增TB细菌中主要的耐药基因靶点,然后再进行测序。Deeplex Myc-TB检测可直接使用从细菌量较少的临床样本中提取的DNA,减少了培养的需求,加快了分析速度。

除了速度,靶向测序方法的另一个优势是测序深度。深度测序很重要,它能让研究人员可靠地捕获携带耐药突变、有可能导致耐药性的菌株亚群。虽然这些亚群只占细菌群落的一小部分,但它们会在治疗中被选择,因此也能在患者中产生耐药性。Deeplex Myc-TB能检测在样本中占比低至3%的携带耐药突变的细菌亚群。

Deeplex Myc-TB检测成功的另一个关键方面是我们成功开发了完全参数化、自动化的网页版应用程序,可快速、简单地分析和解读测序结果。这使得许多不是NGS专家的用户也可以轻松使用该检测。

图1:Deeplex Myc-TB检测的基因靶点包括用于检测已知(红色)和潜在(蓝色)抗TB耐药性相关突变的标记。

Q:你们如何选择用于Deeplex Myc-TB检测的标记?

PS:我们基于先前对结核分枝杆菌主要的耐药性靶点的认识来选择标记。我们确定了由18个基因组成的标记组,也纳入了这些基因中已知的耐药性突变(图1)。

该检测能轻松进行升级。我们计划增加标记数量,纳入最近发布的药物(例如德拉马尼和培托马尼)的靶点。

Q:Deeplex Myc-TB检测已经发现MDR-TB菌株了吗?

PS: 我们对来自南非四个省的TB阳性培养物进行了研究,它们之前的研究使用了GeneXpert MTB-RIF检测和线性探针检测等现有的分子技术,其中的1823株TB分离株最初仅鉴定出具有异烟肼耐药性。3我们随机选择了其中277株分离株,并用利福平耐药性突变特异性检测进行了筛选,然后用MiSeq系统进行了Deeplex Myc-TB检测和WGS来评估各种耐药性、传播和进化的模式。我们鉴定出15%的测试样本中有一个会导致利福平耐药性的特殊突变,该突变目前还未被WHO认可的分子检测或其他检测发现。此外,我们还鉴定出了会导致异烟肼和其他2个一线药物耐药性的突变,将分离株重新归类为对所有一线抗生素耐药的MDR-TB。

我们发现,些菌株中的大多数都来自于同一次爆发。因此,这些菌株逃过了该国的MDR监测。我们也在6株分离株中鉴定出了4个不同的突变,它们可能与贝达喹啉敏感性的下降有关。这完全是出乎意料的。这些患者本不应该接受这种药物的治疗,但我们在这群患者中发现了推定的耐药迹象。

Q:贝达喹啉的耐药性怎么会出现得这么快?

PS: 这是个好问题,但在这个具体案例中,我们还没有明确的答案。我们的系统发育分析结果表明,这些突变的出现发生在该国MDR-TB患者贝达喹啉治疗的临床可及性项目开始之后。同时,我们知道,贝达喹啉和早期的抗TB药物氯法齐明(clofazimine)之间可能存在交叉耐药性。与贝达喹啉耐药性相关的主要基因也是与氯法齐明耐药性相关的主要基因。需要更多的数据才能确定我们发现的突变反映了交叉耐药性还是可能的新药滥用。

“……Illumina NGS系统……也以提供高准确性的突变检测而闻名。这非常重要,因为即便样本中只有少数TB菌株携带了耐药性突变,我们也需要将其检测出来。”

Q:Deeplex Myc-TB检测如何鉴定之前的技术无法鉴定的突变?

PS: Deeplex Myc-TB检测提供的信息比经典的分子方法要多得多。它更全面,它会扩增超过10,000个碱基对,其中包括了主要的TB耐药性靶点。它覆盖了与13个抗TB药物或药物种类的耐药性相关的突变。GeneXpert MTB-RIF检测和线性探针检测等现有技术无法与之匹敌。

GeneXpert MTB-RIF检测基于实时定量PCR,它的速度很快,只需要2小时即可获得结果。但是,它仅覆盖了有限的rpoB基因区域,该区域是导致利福平耐药性的突变热点。因此,它遗漏了新的南非利福平耐药性菌株。这些菌株携带一个位于该rpoB区域外的突变。此外,GeneXpert MTB-RIF检测只能检测利福平的耐药性,不能提供其他抗TB抗生素耐药性的相关信息。

线性探针检测同时利用了PCR和在线探针杂交技术。这些探针只包含某些抗TB药物的常见耐药性突变,并不全面。

Oxford Nanopore系统代表了最近的检测方法,它使用WGS,能捕获更多靶点。但正如我之前所说,WGS检测需要培养步骤来获得足够的DNA。因此,该系统的速度较慢,覆盖深度也通常较低。据我们所知,其测序准确性水平也没有Illumina NGS系统高。这是一个很大的局限性,特别是对于检测少数群体中的突变。

Q:有国际组织在使用Deeplex Myc-TB检测吗?

PS: WHO正在使用我们的检测来进行TB耐药性调查,并在其2018年的技术指南中提到了该检测。4WHO的一些调查数据已经发布,其中一篇涉及对吉布提TB耐药水平的数据挖掘。吉布提没有系统地进行培养。因此Deeplex Myc-TB检测特别有用,该检测可直接使用临床样本,不需要培养。除了吉布提的MDR-TB监测调查,WHO也在其他国家/地区使用我们的检测进行了TB耐药性调查。

"在不远的将来,我认为WHO和许多其他医疗机构将大规模使用基于NGS的靶向检测和WGS检测。"

Q:WHO技术指南中纳入Deeplex Myc-TB检测是否导致使用NGS检测进行监测的卫生机构数量有所增加?

PS: 它增加了我们的检测方法在监测中以及在个体患者TB耐药性的快速诊断中的应用。监测提供了TB流行病学的准确情况,即总人口中的病例数和耐药性的发生率,基于NGS的检测可以在这方面发挥重要作用。WGS和靶向NGS检测可根据从来自个体患者的分离株中获得的基因型信息,提供关于患者群体的耐药性发生率的大量数据。

Deeplex Myc-TB是靶向检测,几乎可以实时地在获得临床样本后立即进行检测。此类检测可提供相关信息,用于快速临床决策,为患者提供最适合的治疗。相比之下,WGS检测的优势在于它可在全基因组水平上精确确定分离株的遗传相关性。因此,它也能提供关于人群中是否有耐药菌株存在的宝贵信息。在不远的将来,我认为WHO和许多其他医疗机构将大规模使用基于NGS的靶向检测和WGS检测。

Q:您和GenoScreen团队为什么选择将Illumina NGS系统应用于该检测?

PS: 我们使用MiSeq、NextSeq 500、MiniSeq和iSeq 100系统等Illumina NGS系统,是因为它们是全世界应用最广泛的NGS系统。在这些平台上开发和验证检测能为我们提供了一个重要的优势,它有利于我们更快速、更高效的推广该检测。这些平台也以提供高准确性的突变检测而闻名。这非常重要,因为即便样本中只有少数TB菌株携带了耐药性突变,我们也需要将其检测出来。

Q:您认为Deeplex Myc-TB检测可以用于发展中国家的TB监测和其他类型的医疗工作吗?

PS: 我们希望Deeplex Myc-TB检测能成为在全世界广泛使用的有价值的工具。除了目前在一些欧洲的中心使用外,该检测还正在贝宁和卢旺达两个非洲国家进行部署。明年年初,我们将启动一个项目,在其他发展中国家/地区对该检测进行临床评估。该评估将与创新诊断基金会(Foundation for Innovative New Diagnostics, FIND)合作进行。FIND获得了联合国国际药物采购机制组织(Unitaid)的一笔资金,专门用于在中低收入国家测试新的基于NGS的靶向TB诊断工具。

Q:基于NGS的TB检测要广泛用于TB监测和诊断,必须先克服哪些挑战?

PS:我们需要先在各个国家的分子生物学设施和技能的发展上取得进展。装备和培训使用基于NGS的Deeplex Myc-TB检测的TB参考中心和实验室,比建立基于细菌培养的检测能力要更容易。事实上,后者需要特殊的生物安全基础设施,而直接使用临床样本的检测则不需要。我们已经在组织现场培训,审查Deeplex Myc-TB检测工作流程的技术步骤。这将确保该检测更容易被接受并得到最有效的使用。

另一个重点领域是根据不同的突变检测对工作人员进行检测数据解读方面的培训。为便于数据解读,我们的测序数据自动化分析网页版应用程序具有非常用户友好的设计。

Q:Deeplex Myc-TB检测开发的后续计划是什么?

PS:除了在Deeplex Myc-TB中添加新靶点来检测对最新TB抗菌药物的耐药性之外,我们还想将其检测范围扩展到其他分枝杆菌。我们有用于麻风分支杆菌(导致麻风病的分支杆菌)的原型检测。就像TB一样,许多人认为麻风病已经成为历史。这种疾病虽然不常见,但在一些地方仍然存在,包括非洲、巴西、印度和中国。原型麻风病检测可检测耐药性并鉴定用于诊断和监测的基因型菌株。该靶向检测虽然没有覆盖完整的基因组,但它可以区分菌株亚系以及在患者群体中传播的药物敏感性菌株或耐药菌株。

深入了解本文提及的系统:

MiSeq系统

NextSeq 550系统

MiniSeq系统

iSeq 100系统

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Illumina NGS technology was used, in combination with other sequencing technologies, to characterize the genome of the coronavirus in China, as published in the New England Journal of Medicine on January 24, 2020. This detailed viral information is enabling public health officials to respond with unprecedented speed and breadth.

References
  1. World Health Organization. Tuberculosis Fact Sheet. www. who. int/en/news-room/fact-sheets/detail/tuberculosis. September 18, 2018. Accessed June 3, 2019.
  2. World Health Organization. The Use of Bedaquiline in the Treatment of Multidrug-Resistant Tuberculosis: Interim Policy Guidance. www. ncbi. nlm. nih. gov/books/NBK154136/. 2013. Accessed June 3, 2019.
  3. Makhado NA, Matabane E, Faccin M, et al. Outbreak of multidrug-resistant tuberculosis in South Africa undetected by WHO-endorsed commercial tests: an observational study. Lancet Infect Dis. 2018; 18:1350-1359.
  4. World Health Organization, Tuberculosis (TB)-Technical Guide on NGS technologies for detection of mutations associated with drug resistance in Mycobacterium tuberculosis complex. www.who.int/tb/publications/2018/WHO_technical_guide_nextgen_sequencing/en/. Accessed June 3, 2019.