新一代测序相较于qPCR的优势

探索能力更强,定量变异的动态范围更宽

NGS vs. qPCR

新一代测序(NGS)技术和qPCR技术的主要差异在于探索能力。虽然两者都具有高灵敏度和可靠的变异检出性能,但qPCR只能检测已知的序列。相反,NGS是一种不需要事先了解序列信息的无假设方法。NGS对新基因的探索能力更强,定量罕见变异和转录本的灵敏度更高。

NGS和qPCR技术在可扩展性和通量方面也有所不同。靶点数量较少时,qPCR是有效的,但是当靶点数量较多时,qPCR的工作流程将非常繁琐。NGS更适合于研究多个靶点或多个样本。一次NGS实验就能以单碱基的分辨率鉴定数千个目标区域的变异。

如何选择靶向NGS与qPCR

了解每种方法的优点与局限性,选择最适合您的方法。

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 qPCR靶向NGS
优势
  • 流程熟悉
  • 大多数实验室已购买资本设备
  • 探索能力更强*
  • 样本通量更高
挑战
  • 只能检测有限的变异
  • 几乎没有探索能力
  • 可扩展性低
  • 对少量靶点(1–20个)的测序不够经济
  • 对少量靶点(1–20个)的测序不够快速

* 探索能力为鉴定新型变异的能力。

NGS相较于qPCR的成本效益

“很明显,通过鉴定变异来开展基因关联研究存在随机性。这就像钓鱼一样。我们意识到,NGS能使我们同时对基因组中更多的区域进行研究。”

Linda S. Pescatello博士
康涅狄格大学运动机能学杰出教授

While qRT-PCR is useful for quantifying the expression of a few genes, it can only detect known sequences. In contrast, RNA sequencing (RNA-Seq) using NGS can detect both known and novel transcripts. Because RNA-Seq does not require predesigned probes, the data sets are unbiased, allowing for hypothesis-free experimental design.

For read-counting methods, such as gene expression profiling, the digital nature of NGS allows a virtually unlimited dynamic range. RNA-Seq quantifies individual sequence reads aligned to a reference sequence, producing absolute rather than relative expression values. This broad dynamic range enables detection of subtle changes in expression, down to 10%. Beyond quantifying gene expression, RNA-Seq can identify novel transcripts, alternatively spliced isoforms, splice sites, and small and noncoding RNA.1,2

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NGS vs. qPCR
RNA-Seq vs. qPCR for Differential Gene Expression

An Illumina scientist evaluates how custom targeted RNA-Seq compares to qPCR for differential gene expression analysis.

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虽然qRT-PCR可以对少数基因的表达进行定量分析,但它只能检测已知的序列。而使用NGS进行RNA测序(RNA-Seq)可以同时检测已知的和新的转录本。由于RNA-Seq不需要预先设计探针,所以能够获得无偏向的数据集,允许进行无假设的实验设计。

新一代测序的数字化特性,可让诸如基因表达图谱分析之类的read计数方法实现近乎无限的动态范围。RNA-Seq可以对比对到参考序列的单个测序read进行定量,生成绝对表达值而不是相对表达值。这种宽动态范围可以检测表达低至10%的细微变化。除了定量基因表达,RNA-Seq还可以识别新的转录本、选择性剪接异构体、剪接位点、小RNA和非编码RNA。1,2

RNA-Seq与qPCR在探索生物标记方面的差异

从qRT-PCR转换至RNA-Seq后,Bosiljka Tasic博士能够鉴定以前从未发现的标记。

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需要根据样本数量、目标区域的序列总数、预算和研究目标等因素选择使用NGS还是qPCR。当目标区域数量较少(≤20个),且研究目标仅限于筛查或鉴定已知变异时,qPCR通常是不错的选择。其他情况下则NGS更能满足您的需求。与传统的反复检测方法相比,靶向NGS可以同时对多个样本中的多个基因进行测序,节省时间和资源。NGS的探索能力也更强,支持新型变异的检测。

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参考文献
  1. Ozsolak F, Milos PM.RNA-Sequencing: advances, challenges and opportunities.Nat Rev Genet.2011;12:87-98.
  2. Wang Z, Gerstein M, Snyder M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics.Nat Rev Genet.2009;10:57-63.